紫外检测器高效液相色谱仪的检定操作规程

1. 说明
1.1. 适用范围：适用于具可变波长紫外检测器的高效液相色谱仪的检定。
1.2. 参照依据：国家技术监督局JJG705-2002“实验室液相色谱仪检定规程”、相关仪器操作说明书及中国药典2005版二部附录VD制定。
1.3. 仪器操作及环境条件：应符合相应仪器的操作及维护规程(SOP)。
2. 检定项目和技术要求
2.1. 泵流量设定值误差应Ss≤±2%；流量稳定性误差应SR≤±2%。
2.2. 柱温箱温度设定值误差ΔTs应不超过±2.0℃；柱温箱温度稳定性应不超过1.0℃。
2.3. 波长示值误差应＜±2nm； 波长重复性应优于1nm。
2.4. 定性测量重复性误差(5次定量环进样)应RSD≤1.5%。
2.5. 定量测量重复性误差(5次定量环进样)应RSD≤1.5%。
2.6. 基线漂移应≤5×10-3(Au/h)，基线噪声应≤5×10-4Au。
2.7. 最小检测浓度应不超过4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）。
2.8. 梯度误差Gc应不超过±3%（无梯度装置不进行此项检定）。
3. 检定方法
3.1. 泵流量设定值误差Ss，流量稳定性误差SR的检定
3.1.1. 仪器与用具
     分析天平   万分之一      秒表       精度0.01秒     容量瓶     50ml
3.1.2. 操作程序
3.1.2.1. 将泵、进样器、色谱柱和检测器连接好，以甲醇为流动相。
3.1.2.2. 按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先精密称定过重量的容量瓶收集流动相，同时用秒表记录，准确收集10～25分钟，再精密称定其重量。收集时间
应符合下表规定，每个设定值重复测定3次。
3.1.3. 结果计算
按下列公式计算SS和SR：
Fm=（W2-W1）/（P.t）
SS=（Fm-FS）/FS×100%
SR=(Fmax-Fmin)/F×100%
W2为容量瓶+流动相的重量(g)
W1为容量瓶的重量
P为实验条件下的流动相密度(g/cm3)
t为收集流动相的时间(min)P
Fm流量实测值(ml/min)
FS流量设定值
Fmin同一组测量中流量最小值
Fmax同一组测量中流量最大值
F为同一组测量中流量的算术平均值
3.1.4. 结果判断：SS和SR值应符合下表规定
流量设定值(ml/min)        0.5        1.0        1.5
测量次数        3        3        3
收集流动相时间(min)        25        15        10
允许误差        SS        3%        2%        2%
        SR        3%        2%        2%
3.1.5. 注意事项:收集时间应将“秒”换算为“分”代入公式计算。
3.2. 柱温箱温度设定值误差ΔTs、柱温箱温度稳定性Tc的检定
3.2.1. 操作步骤：将温度设为60℃，将一经过校正的温度计放入柱温箱内，每隔10min读取温度计显示温度与柱温箱显示温度一次，共读取7次，求出平均值。平均值与设定值之差为ΔTs，7次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性Tc。
3.2.2. 结果判断：柱温箱温度设定值误差ΔTs应不超过±2.0℃；柱温箱温度稳定性应不超过1.0℃。
3.3. 波长示值误差及波长重复性的检定
3.3.1. 方法
3.3.1.1. 方法一
制备60ug/ml基准重铬酸钾的0.005mol/l硫酸溶液，用一节空管代替色谱柱将进样器与检测器连通，以水做流动相，流量为0.5～1.0ml/min，采用步进进样法，即在235nm±5nm、257nm±5nm、313nm±5nm、350nm±5nm四个波段处，分别每2min改变1nm，用注射器注入5～10ul（或定量环）标准溶液，重复测量三次。记录色谱图。
3.3.1.2. 方法二
制备60ug/ml基准重铬酸钾的0.005mol/l硫酸溶液，按紫外分光光度法，用1cm石英比色皿分别在235nm±5nm、257nm±5nm、313nm±5nm、350nm±5nm四个波段处，以0.005mol/L硫酸为空白，测定各波长处60ug/ml基准重铬酸钾的0.005mol/l硫酸溶液的吸收度，各波长重复测量三次。
3.3.1.3. 方法三
对于仪器有波长准确度自检功能的,可利用其自检功能进行检查，重复测量三次。具体详见相关仪器操作说明书。
3.3.2. 结果计算：
最大（或最小）吸收点对应的波长与标准波长之差即为波长示值误差。
三次测量平均值与三次测量值中最大差值即为波长重复性误差。
3.3.3. 结果判断：波长示值误差应＜±2nm；波长重复性应优于1nm。
3.4. 基线漂移和基线噪声的检定
3.4.1. 色谱条件：
色谱柱：C18
流动相：甲醇
流速：1ml/min
波长：254nm
3.4.2. 操作步骤
将仪器各部份联接好，将灵敏度设置为最灵敏档，开机，以甲醇为流动相，待基线稳定后,记录基线 10min，计算基线噪声。
记录基线 60min，计算基线漂移。
3.4.3. 结果计算：
Nd=KB
式中：    Nd--检测器基线噪声；
K--衰减倍数；
B--测得的基线峰-峰高对应的记录仪标度，AU
基线漂移用1h内基线偏离原点的值（AU/h）表示。
3.4.4. 结果判断：
基线漂移≤5×10-3(Au/h)
基线噪声≤5×10-4Au
3.5. 最低检测浓度的检定
3.5.1. 对照品溶液的配制：用甲醇配制含萘4×10-8g/ml的甲醇溶液。
3.5.2. 色谱条件：
色谱柱：C18
流动相：甲醇
流速：1ml/min
波长：254nm
进样量：20ul（定量环）
3.5.3. 操作步骤：将仪器各部份联接好，以甲醇为流动相，开机，待基线稳定后，将上述配制好的对照品溶液进样，记录色谱图。
3.5.4. 按下式计算最小检测浓度：
              Cl=2•Nd•C/H
式中：Cl：最小检测浓度（g/ml）；
Nd：基线噪声峰-峰高，mm；
C：对照品溶液浓度（g/ml）；
H：标准溶液的色谱峰高，mm。
3.5.5. 结果判断：对照品溶液的峰高应大于或等于两倍基线噪声峰高，即最低检测浓度应低于4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液）。
3.6. 梯度误差的检定
3.6.1.色谱条件
流动相：A为纯水；B为0.1%丙酮水溶液
流速：1ml/min
波长：254nm
3.6.2. 操作步骤：将输液泵和检测器连接（不接色谱柱），开机后以溶剂A冲洗系统，基线平稳后开始执行下列梯度程序，记录色谱图。重复测量2次。
3.6.3. 梯度程序：

A：系统是色谱工作站控制的，按下表程序：
时间        流速        A%        B%
0 min        1ml/min        100%        0%
3 min        1ml/min        100%        0%
5min        1ml/min        80%        20%
8min        1ml/min        80%        20%
10min        1ml/min        60%        40%
13min        1ml/min        60%        40%
15min        1ml/min        40%        60%
18min        1ml/min        40%        60%
20min        1ml/min        20%        80%
23min        1ml/min        20%        80%
25min        1ml/min        0        100%
28min        1ml/min        0        100%
30min        1ml/min        100%        0
B：系统是梯度控制仪控制的，按下表程序：
时间        流速        A%        B%
0 min        1ml/min        100%        0%
3 min        1ml/min        100%        0%
5min        1ml/min        75%        25%
8min        1ml/min        75%        25%
10min        1ml/min        50%        50%
13min        1ml/min        50%        50%
15min        1ml/min        25%        75%
18min        1ml/min        25%        75%
20min        1ml/min        0        100%
23min        1ml/min        0        100%
25min        1ml/min        100%        0
3.6.4. 结果计算：
      
式中：
--第i段梯度误差（%）；
--第i段输出信号值平均值；
--各段输出信号平均值的平均值。
3.6.5. 结果判断：不超过±3%
3.7. 定性、定量测量重复性试验
3.7.1. 色谱条件
色谱柱：C18
流动相：甲醇
流速：1ml/min
波长：254nm
进样量：20ul（定量环）
3.7.2.操作程序
将仪器连接好，使之处于正常的工作状态，待基线稳定后，用进样阀的定量环注入20ul4×10-5g/ml萘的甲醇溶液或稳定的待分析样品溶液，连续进样5次，记录萘的峰保留时间和峰面积。
3.7.3. 结果计算：

式中：
RSD%--定性（定量）测量重复性相对标准偏差；
Xi--第i次测得的保留时间或峰面积；
--5次测量结果的算术平均值；
i--测量序号。
3.7.4. 结果判断
定性测量重复性误差：5次峰保留时间相对标准偏差(RSD)应≤1.5%。
定量测量重复性误差：5次峰面积相对标准偏差(RSD)应R≤1.5%。
4. 检定周期
4.1. 法定检定周期为1年。
4.2. 仪器维修或发现异常时应全面检定一次。
4.3. 正常自检按下表执行：
检 定 项 目        周  期
泵流量设定值误差、流量稳定性误差        12个月
柱温箱温度设定值误差ΔTs、柱温箱温度稳定性        12个月
波长示值误差、波长重复性        12个月
基线噪声及漂移        12个月
最小检测浓度        12个月
梯度误差Gc        12个月
定性、定量测量重复性误差        12个月