微球在流式荧光中的应用

流式荧光技术，是基于美国Luminex公司研制的多功能流式点阵仪（Luminex 100™）开发的高速度、高通量、并行检测的生物技术平台。它有机地整和了编码微球（color-coded  beads）、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了其无与伦比的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学研究中的一大热点。
流式荧光技术是基于激光激发荧光的发光类技术之一，又称悬浮阵列、液态芯片。具有三大无与伦比的核心优势：
    微量标本，1检测，100个指标
    既能检测蛋白，又能检测核酸
    既能用于临床，又能用于科研
流式荧光技术原理：
该技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6μm）用荧光染色的方法进行编码（微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球），然后将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。最后用Luminex™100进行分析，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标。

流式荧光技术优点：
1、 高通量：仅需微量样本（10μl），1次检测，最多100个指标；
2、 高速度：最快可达10000测试/小时；
3、 低成本：流式荧光联检的试剂用量少，能有效降低临床应用的试剂成本；
4、 灵敏度高：检测低限可达10pg/ml；
5、 重复性好：每个指标有5000个反应单元，分析100次取平均值；
6、 线性范围广：检测范围达6个数量级；
7、 无需洗涤：减少误差来源，且操作简便、省时省力。
权威认证：
1997年，Clinical Chemistry杂志刊登专文介绍多功能流式点阵仪及其技术，并将其誉为“真正的临床应用型生物芯片”。随后，运用多功能流式点阵仪及其技术进行临床诊断和基础研究成为生命科学研究领域的一大热点，相关的研究论文频频刊登在Nature、Clinical Chemistry、Clin Biochem、Clin Chem Lab Med、Clin Diagn Lab Immunol、Lancet Oncol、Journal of Molecular Diagnostics、Genome Res、J Proteome Res、Cytometry、Journal of Clinical Microbiology、Clin Dev Immunol、Cancer、Cancer Research等国际权威学术杂志上。2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列流式点阵试剂率先通过美国FDA的严格认证，标志着多功能流式点阵仪及其技术得到了美国官方的高度认可，并由此成为首个，也是目前唯一得到美国FDA许可用于临床诊断的多指标并行检测技术。2005年6月9日，基于xMAP技术的学术论文刊登在当日出版的《自然》杂志上，这是学术界认可一项技术所能给予的最高荣誉。2005年11月，为了表彰其对临床诊断技术进步做出的革命性贡献，全球科技产业和行业研究的权威机构Frost & Sullivan授予xMAP技术“2005年度国际临床诊断技术革新大奖”，标志着xMAP技术在国际临床诊断技术领域的领军地位得到了最具权威的认可。
独特优点：
液态芯片的独特设计使得它拥有常规检测方法所不具备的优点：
高通量：因为许多种不同荧光编码的微球可以放在同一个反应体系内，所以一次可以同时检测多种（100种）生理病理指标。这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞跃。
高敏感：液态芯片最高的灵敏都可达0.01pg，常规的酶标（ELISA）方法只能是ug级。灵敏度提高10－100倍。液态芯片技术应用时，每个微球上都以共价结合的方式包被上许多抗原、抗体或核酸分子。因其参与反应的分子多，反应基本是在类均相的条件下进行的，反应充分，产生的信号强。加上使用激光激发荧光检测，所以敏感性大大高于常规的酶标、玻璃或膜生物芯片等方法，与发光的方法比，敏感性等同或略高。
线性范围宽：检测的线性范围比常规的ELISA方法高10倍以上，可以达到3-5个数量级。检测浓度范围可以在pg-μg级。这 明显优于酶免疫分析吸光度2个数量级的检测范围。
反应快速：因为杂交或免疫反应在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短，杂交后常不用清洗就可以直接读数，所以检测效率大大高于 固相杂交，所用时间从几小时缩短到十几分钟。
重复性好：固相芯片不能很好地应用于临床诊断，其中一个重要的原因是其重复性差，这是固液杂交方式的芯片目前难以克服的技术障碍 。但液态芯片杂交发生在准均相的液体环境中，其结果稳定，重复性非常好。另外，每个指标在一个反应体系中有1000－5000颗相同的微球。检测时，抽取其中的100－500颗读数，最终的数据是取其均值，这样已经把误差减到最小。而固相芯片每个指标只有 1－2个数据，其数据的可靠性就会差很多。
液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应。
操作简便：凡有固体芯片应用经历的操作者都会发现，与现有的大量采用自动化技术的临床检验设备来说，芯片技术手工操作的步骤非常繁多。但此技术平台的整个反应过程只涉及加样和孵育，最后上机读数，操作步骤少，非常简单易用。
液态芯片应用
作为最新一代的多指标并行检测技术平台，多功能流式点阵仪具有检测速度快、结果准确性高、操作简便、功能强大、成本低廉等诸多优点，在临床诊断、健康体检、生物制药、生物医学（包括基因组学、蛋白质组学）研究等领域都有着广泛的应用，代表着生命科学基础研究和医学诊断技术的发展方向。该仪器一经推出，便在医学诊断与基础研究的各个领域得到了迅速推广，最近3年来更是以每年高达600～800台的速度在迅猛递增。根据Luminex公司提供的统计数据，截止2005年底，已有3400多台多功能流式点阵仪在全球各大权威实验室、临床诊断科、主要的诊断试剂和生物技术公司、制药企业中投入使用。
在液态芯片平台上可以开发许多产品，根据检测机理的不同，可大致分成两大类：
蛋白芯片：基于的原理是抗原抗体的特异性相互作用，它所检测的目标物是蛋白；
基因芯片：基于的原理是核酸分子杂交，它所检测的目标物是核酸。
液态芯片技术平台及其产品在生命科学研究的诸多领域有着广泛的应用前景：
临床诊断
基础研究
免疫学分析
受体－配体分析
基因组学研究
蛋白质组学研究
酶与底物相互关系的研究
新药开发
司法鉴定
食品卫生监督
生物武器防范
国内外目前有20余家公司正在研究基于液态芯片技术的产品，涉及的领域主要有：
1. 免疫学或基于免疫学原理进行的分析
- 肿瘤标志物检测
- 细胞因子检测
- 组织分型
- 自身免疫病检测
- 过敏原筛查
- 心血管疾病标志物检测
- 感染性疾病（如乙肝等）的检测
2. DNA杂交分析
- 感染性疾病病原微生物（如HPV等）的检测
- SNP检测
- 基因表达谱分析
3. 基因及蛋白质表达谱分析
- 蛋白质－蛋白质相互作用分析
- 蛋白质－DNA相互作用分析
4. 高通量药物筛选平台
- 高通量、大规模、并行进行药物筛选
- 直接在蛋白水平寻找靶标
- 解释药物的作用机理及毒副作用
5. 受体－配体分析
- 内分泌激素分析
6. 酶与底物的相互作用的研究
- 激酶和磷酸化分析
- 金属蛋白酶类分析