紫外-可见分光光度法的固有标准

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摘要：本文对以氧化钬溶液为近紫外和可见光谱区的波长参考物的多通道研究结果进行了综述。

Intrinsic Standards for UV-VIS Spectrophotometry

John C. Travis, David L. Duewer, and Marc L. Salit

Abstract:The results of a multicenter study into the use of holmium oxide solution as a wavelength reference material in near UV and VIS is reviewed.

21 世纪的全球销售市场和国际执行标准为适合作参考的物质提供了平稳的需求。国家计量研究所（NMIs），如NIST（Gaithersburg, MD）通常都有为这类参考物提供具有追踪能力的（traceability）后台支撑，这里的追踪能力指的是“某仪器测定结果或标准值的属性，它通过一条可与所有规定的不确定性进行比较的完整通道与国家或国际的标准相联系”。此处的测定结果或标准值能与规定的参考相关联，这里的参考通常是国家或国际的标准，它通过一条完整的链比较所有规定的不确定性[1]。将参考物传送到终端用户的有效系统是开始于响应和竞争性二级标准生产者，这些标准生产者具备证明他们产品有追踪能力。通过使用固有标准可使效率进一步提高，在此以波长标准及其吸收标准的应用为例加以说明。

        图1 左侧说明给出了借助一个二级人工波长标准从SI 米到终端用户的传统追踪通道。正如图1右侧所示，通过固有（数据）标准的使用，可以缩短追踪通道中接线的数目。固有标准是“基于充分表征的物理学原理、自然界的基本常数或物质的不变属性以及如果经过合理的设计、表征、操作、监测维护而制得的理想、稳定、精确、准确的测定标准”[2]。10% （体积分数）的高氯酸中含40g/L 氧化钬溶液所产生的紫外- 可见吸收谱带适合作波长标准。经核定的作为固有标准的氧化钬溶液声明将链中顶部的节点锁定为单阶可追溯到米文件。尽管固有的数据已经公布且被同行审查过，但为了通过已发表的和被审查过的内在数据来声明其维护追踪能力，二级标准品生产者只需根据说明生产溶液并将其密封于试管或安瓶内即可。

1 氧化钬溶液为波长参考物

        上述的氧化钬溶液于1985年由NIST（当时所谓的国家标准局，或称NBS）于1985年作为标准参考物（SRM）2034 引进作为标准参考物（SRM）2034，。其中有14 条经核定的波段作为被核定为透光率最小值（在空气中波长单位纳米）的光谱位置，见图2[3，4]中数字所标明的波段。12 批这类标准（200-250 单位/ 每批）于1985-2002 之间生产，使用的波段最低值，最初分配在1985 系列的仪器光谱带宽的（SBM）6 个值。

        基于最初的两个波长比较使运用[5,6]，SRM 2034核定值的不确定性为2001 和2002批次所修正。这些研究同时证明了两个完全独立的氧化钬溶液形式组成的可比较性和多通道中心方法对于核定值再次分布给透过率最低点的优越性[7]。

2 多通道中心研究
        作为最初的比较结果，14 个国家的22 台仪器（见表1）已参与另一项研究用于将新的核定值和不确定性分配给14 个最初核定的波段光谱位置，以及图2 中字母所标明的4 条另外的波段8[8]。除了将多通道中心测定用于SRM 2034的2002 系列样品外，NIST 主体实验室对于由其他生产商所生产的6 种氧化钬溶液样品和11 种NIST SRM 2034用于支持固有标准内标所要求的普遍性的优先系列试样作了进行附加补充比较。在NIST 中的补充研究包括浓度和温度的相关互依赖性。为了作为起着对合适的吸光光度法的固有内在波长标准的氧化钬溶液中18 条波段的声明，在别处对多通道中心和补充结果在别处做了详细说明。

3 仪器校正
        在多通道中心研究中要求每个参与者提供他们所使用仪器的原始刻度的独自的立波长校正。图3 给出了上述校正的首选方法，该图给出表明了原子光谱线的指示位置和仪器指示波长间的偏差相对于仪器指示波长的函数关系。偏差的定义为“谱线中心指示的波长值减去谱线中心的已知值，正如原子光谱线评估表所报到的[9]”。低次多项式名（如抛物线所示）与这类偏差数据拟合提供了一平滑的偏差校正函数用以校准显示在仪器上的数据的波长刻度。平滑拟合曲线的数据点的较大分散性大于由，用干涉测量法测定的原子线位置的不准确度或测量仪器的精确度所还不能解释的。图3 中的误差条形图代表置信区间为95% 的峰位置重现性，谱线位置已知值的不准确度比峰位置重现性小得多。拟合的分散常被视为看作代表现仪器器件的光学队列序列中的机械缺陷，残数拟合的计算标准偏差被视为校正一台仪器能力的指示器。校正不准确度的数量级在±0.1 nm 通常为认为是研究级的分光光度计所引证。

        每台参与的仪器都得到一张类似图3 的显示氧化钬溶液在3 段光谱带宽的所有被测波段偏差的示意图并显示偏差，即测得的波段位置和公论值的差别，公论值为氧化钬溶液在3 段光谱带宽的所有被测的波段。对于较窄的两条带宽，偏差值通常集中在由原子线校正经验所预测的范围内。然而，如图4所给出显示的几种参与的仪器，对于3.0nm 光谱带宽，偏差接近0.3nm 的情形是少见的。这些结果（和在NIST 所做的支持的实验）的最终结论是只要光源溢出狭缝和视觉场范围，入射口狭缝则将决定单色器输入的光轴。对于一个研究用实验分光光度计，宽物理狭缝要求回到3nm 谱带宽度时，光源可以不溢出狭缝或成像不超出狭缝。在这种情形下，在决定单色器的入射轴时，光源的准直比物理狭缝的中心更重要。对于每一个用于测定原子波长的记录灯，以及对在正常运行仪器的连续灯（钨灯和/或氘灯），该效果可导致不同的有效波长的校正。事实上，从图4 中的一些结果有可能以觉察出钨灯（＞350 nm）和氘灯（＜350 nm）的校正差别。
        图4 中一有趣的隐义是显示数据的仪器通过使用基于吸收的波长标准校正比以原子线校正的方式更能得到一致的波长标度。从另一方面而言，一致性并不是精确性的必然。在一致性数值中如何估算它的不确定性，特别是在研究级仪器无法准确校准的3.0nm 光谱带宽处实验级仪器无法被准确校准。这就是多通道中心方法的长处，因为校正大批量仪器的困难之处似乎是它们的“随意性”。因此，当参与者的数量增加时，平均值越来越成为真值有用的估价者。尽管单个测量的离差大于校正某一台校正仪器的常规估算能力，事实上平均值的离差更小，因为它的标度与参与者数量的平方根成反比。尽管图4 中显示出了个体的变化，事实上几乎所有核定值的最终扩展的不准确度（置信区间为95%）落在常规的± 0.1 nm 范围内。

4 将延伸结果扩展到具有大谱带宽度的仪器
        对被用于更宽的光谱带宽的固有标准进行核定时，其所遇到的困难通常比实验级的仪器更大、更严重。在没有仪器影响的情况下，通过物质的固有光谱，对于某一给定的光谱带宽，一潜在的解决办法是通过卷积理论三角的狭缝函数计算生成展宽的固有光谱。鉴于此目的，在0.1nm光谱带宽处所获得实验光谱充分展现表示了一个不变形的分子光谱，以用普通的电子制表软件功能很容易计算得到理论预测展宽的光谱，详解如图5 所示。

        尽管不易看出图上的标度，但由于谱带形状的不对称性，大多数吸收谱带的外观的最小值随光谱带宽移动是明显的。对于0.1~10.0 nm 范围内以0.1 nm 增量的光谱带宽以卷积方式产生的光谱，其已被用于与基于计算机的谱带最小单元结合产生弹道曲线。这些弹道曲线与测得的值具有很好的一致性，直到最大的实验谱带宽度3.0 nm 还具有很好的一致性。因此，既定的固有值被定为核定值超出3.0 nm 和3.0~10.0 nm 的信息值。这些语义的差别来源于插值计量学规则而不是实验结果的推断。然而，人们希望更宽的谱带宽度的量以满足这类仪器执行有效性的需求。
5 实际分布和使用
        将氧化钬溶液的透射光谱谱带的最小值定义为固有的波长标准减缓轻了在SRM 2034 批次之后NIST 生产批量的任务，且生产将真正随2004 系列终止。但是为了应用固有标准内标的结果，终端用户将依旧需要人工生产溶液。商品化的及通过其它的NMIs 得到的溶液在研究中被列出以提供能与SRM 2034 相比较的结果。只有两个例子在某一波段的光谱位置处可检测出不同，这两例氧化钬的质量浓度明显不同（其中一个为20 g/L，另一个标为60 g/L），生产商和终端用户通过目视比较光谱并同预期的对比可以核验定出某一样品是否合适，例证如图2和图5所示。许多仪器的波段定位（或拾峰）由仪器的软件提供并按软件说明使用，程序的适宜性可由偏差曲线所观察到的结果判断，后者可通过将实验所测得波段位置减去核定值，以核定值作为指示波长的函数绘制曲线（对于具有合适谱带宽度的波段），用户可以遵照下面几条路线：
        1. 可接受的。如果采纳由UV光谱范围的美国药典（USP）[10]，欧洲药典（Ph. Eur. ）[11]，the Deutches Arzneibuch（DAB）[12]，以及治疗货物管理局（TGA）[13]推荐的公差（对于全刻度）值±0.1 nm，则能划出一条水平线在±1 nm 处横截偏差曲线的纵轴，观察是否所有的偏差都落在所定义的波段内。很显然，他们对所有的波长偏差对在图3 和图4 中所指示的仪器都有效。当某些偏差接近公差极限时，切割点不太清析，此时必须考虑核定值的不准确度、仪器的精度以及简化的公差。但是在同专用仪器的准确度（上述执行标准在可见光谱范围内的分析公差为±3 nm）相比，分析公差常常是大方的（generous），从而进入到下一个方法。
        2. 叫工程师来调整波长刻度。如果有好几个偏差点开始接近公差极限时，此时应该和工程师联系而不是担忧心误差传播等等诸如此类的问题。
        3. 使用拟合偏差函数进行波长校正。波长偏差数据的拟合所提供的平滑分析表达式可以将仪器设置为校正的波长或纠正扫描的波长轴。举例来说，如果分析方法需要在波长280 nm 处测试，而拟合偏差曲线在280 nm 处的偏差指示为+0.55 nm，那么仪器的指示波长将被设置为280.55 nm 从而能在真实波长280 nm 处获得吸收读数。需要简化处理关系式“偏差= 指示的- 真实的”，从而发现“指示的= 真实的+ 偏差”。
        总之，选项是确认（如果必要，带有维修）或校正。此处线与线间的暗隐是计算机或微处理器面板控制现代仪器的事实。如果应用程序具有这种特征的话，便有可能在软件中重新校正波长轴。这一选择有益于进行仪器手动扫描或实现在线技术支持。
6 结论
        尽管氧化钬溶液在很多方面提供了充足的波长校正范围，然而在额外的光谱区，其它稀土元素有效地提供了锐的吸收波段。由政府化学家（LGC，Teddington, U.K.）提供的稀土混合物，包括氧化钬和氧化钕，氧化物将波长范围扩展到219～865 nm[14]。图6给出了表明钕元素加入一些孤立的波段到钬元素的光谱中，并与钬元素的一些波段产生干扰。近来的商品化稀土溶液在210-254 nm 之间提供5 个校正波段，该波段区域是一个重要的光谱区域且氧化钬溶液并不提供该项服务[15]。这些额外的稀土过渡元素代表了内在固有波长标准物的替补，需要分别在时间、环境微扰和核定值的协作指定方面需要作进一步研究波段位置的稳定性。

        紫外- 可见吸收分光光度计的标度是基于一比值（光的透射率），因此它对一些潜在的误差源是不敏感的，然而需要确认以保证仪器正常运行。尽管普遍使用灰色玻璃和含金属的熔融硅中等密度滤光片，但是在固定的时间间隔内做单个的校验是低效而麻烦的。重铬酸钾作为UV 的实际固有标准时，吸收峰分别在257 nm 和350 nm 被验证，吸收谷分别在235 nm 和313 nm 被验证。对于特定浓度和溶剂的目标值和宽容的generous 公差极限，由Ph. Eur.，DAB，TGA，英国药典（BP）[16]和日本药典（JP XIV）[17]指定。ASTM 标准规则E 295-02[18]提供预期的吸收值，该值由已知的NIST SRM 935a 固有的吸收率计算得到（以晶体重铬酸钾晶体作为紫外吸收的的标准）[19]，NIST SRM 935a 只给予说明性的公差。重铬酸钾吸收率的国际值的指定行为或许是有利的。
        迄今，还没有公认的候选物质对于整个UVVIS 光谱区域范围提供固有的吸收。使用公认的、稳定的氧化钬溶液的光谱来同时校正/ 确定波长轴和吸收轴这一方法是有趣的且有前景的。有必要用计算机将被校验的光谱和实验测定的光谱进行集中全谱拟合以提供基线修正、波长校正、谱带宽度测定以及吸收值的确定。
        最近由NIST 化学科学和技术实验室（CSTL）发起的导航研究为充分地generous 宽容的吸收公差证明校验原理这一概念。这一方法将为240- 650 nm 和0～1 范围的吸光度单位提供简单而有效的作用范围。使用更高浓度的溶液或吸收光程可以达到更高的吸光度值。
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