显微镜的发展及在长度计量中的应用

显微镜的发展及在长度计量中的应用
王蔚晨  何冬琦  莫伟平  杨自本



    自16世纪末第一台显微镜发明以来，显微技术一直是人们探寻和研究微观世界的有力助手，特别是计算机和激光器的问世更为古老的显微技术注入了新的生命力。几个世纪中，显微镜从过去传统的光学显微镜逐渐向深度和广度发展，形成了以不同照明光源和成像原理为区别的一个庞大的显微镜家族，如光学显微镜、干涉显微镜、电子显微镜和扫描探针显微镜等。而其中每一类显微镜又自成体系，向纵深衍生出更多类型的显微镜而应用于各个科学技术领域。
   
一、显微镜的发展
    从显微镜诞生至20世纪20年代的500年间，人类为提高显微镜分辨率的努力一直局限在优化显微镜分辨极限的表达式中所涉及的光学参数，科学家们竭尽所能寻找波长更短的照明光源和提高物镜的数值孔径，以期提高显微镜的放大倍数及其分辨率。基于这一思想，长期以来，发展出更多类型、更多用途的显微镜。但根据式(1)计算，显微镜的分辨极限最好也只能达到波长λ的1/2，因此，工作在可见光波段的光学显微镜很难突破0.2mm的分辨极限。
    显微镜家族成员众多，分类方法也多种多样。按照成像原理划分，可分为光学显微镜、干涉显微镜、共焦显微镜以及扫描探针显微镜；按照信息载体波长的由大到小划分，可将显微镜分为传统光学显微镜和非可见光源照明显微镜；按照工作方式划分可分为近场显微镜和远场光学显微镜等，如图1所示。
   

    图1  显微镜发展简图

    但无论是成像原理上还是照明光源上的区别，各种类型显微镜的共同点均是基于轴向放大功能的仪器，根据放大原理和方式的不同得到不同类型的显微镜，其放大能力也有所不同，表1列出了现有应用较为广泛的显微镜的分辨率数值。
   

    表1  常见显微镜的分辨率

    1.传统光学显微镜
    传统的光学显微镜是以光波作为信息载体实现对样品的观察的，因而光学显微镜最突出的优点是对被观察物体不构成损伤，且对样品限制少，即对样品的状态、属性、材料、温度、透明与否等都无限制，对测量环境也无特殊要求，这使得它的应用范围非常广泛。因此，在非光学显微镜的分辨率已经达到原子级(0.1nm)水平的今天，提高光学显微镜的分辨率仍具有重大意义。
    光学显微镜按照其功能大致可分为观察用显微镜和测量用显微镜两大类。观察用显微镜主要包括生物显微镜、金相显微镜等，主要应用于医疗、教学、机械制造、电子等领域。测量用显微镜则包括读数显微镜、测量显微镜、工具显微镜、光切显微镜、干涉显微镜等，在工业生产、产品检验、计量测试、科学研究、航天航空等领域，其作为主要的测量工具发挥着重要的作用。
    2.新型显微镜
    为了突破传统光学显微镜的测量极限，科学家们努力寻找不同光源作为显微镜的信息载体，超声显微镜、X射线显微镜和电子显微镜等应运而生。
    (1)超声显微镜
    超声显微镜(以下简称“声镜”)是以超声波为载体，并使其沿一定路径传播、转换，从而显示物体细微结构的显微装置。声镜的工作原理是:入射到物体上的声波经过反射、折射、衍射、吸收等声学现象与物体发生相互作用而携带了物质的信息，这些信息反映了物体结构、性质等特性，把携带物质信息的声波显示出来即实现了声成像。声镜的成像过程如图2所示。压电换能器由信号源激发产生超声波，经超声透镜聚焦成细声束，通过耦合介质-水入射到被测样品，穿过样品到达对面的共声透镜，携带样品信息的声波经压电换能器在此将声波转换为电信号并经接收电路送到示波器，样品放在载物台上可作二维移动，聚焦声束在样品上作逐点逐行的扫描，示波器可显示出物体被照射部位的声像。为了获得短波长声波，从而提高声镜的分辨率，美国斯坦福大学将传导介质换成低温液氦，使声镜的分辨率达到了50nm。
   

    图2  声镜原理图

    声镜是利用物体声学特性的差异来显示物体的，物体的声学特性是指声阻抗和声衰减，这些参数与物体结构、成分、弹性等有关，而与物体的透光性和颜色无关。基于这一机理，声镜显示出其显著的特点:一是被测物体无需透光；二是样品无需进行染色处理，即无需损坏样品就可进行内部观察。因而，声镜在生物、医学、微电子学以及材料学中得以广泛应用。例如，利用声镜进行活体样本观察、对大规模集成电路不同层次和层间细节进行非破坏性观察、对材料表面层断裂韧性进行测定等。因此，声镜与光学显微镜和电子显微镜相互补充，成为现代显微技术发展进程中的一个重要里程碑。
    (2)电子显微镜
    电子显微镜是以电子束为照明光源的显微镜，由于电子波的波长大大小于可见光的波长(约为紫光波长的十万分之一)，根据式(1)可知，电子显微镜的分辨本领应大大优于光学显微镜。现代电子显微镜的分辨率已经可以达到0.1nm。电子显微镜可分为扫描电子显微镜(以下简称“扫描电镜”，SEM)和透射电子显微镜(以下简称“透射电镜”，TEM)两大类。
    扫描电镜是利用聚焦电子束垂直于被测物体进行扫描，检测其背向散射电子和二次发射电子信号的变化获得样品形貌衬度像。扫描电镜的基本工作过程如图3所示，用电子束在样品表面扫描，同时，阴极射线管内的电子束与样品表面的电子束同步扫描，将电子束在样品上激发的各种信号用探测器接收，并用它来调制显像管中扫描电子束的强度，在阴极射线管的屏幕上就得到了相应衬度的扫描电子显微像。由于获得的电子像的分辨率和景深都远远高于光学显微镜，因此，扫描电镜可在比微米尺寸更小的范围获得高倍率、立体感强且直观的显微形貌像。目前，商用扫描电镜的分辨率可达到纳米级。此外，利用能谱仪等附件扫描电镜在对样品进行形貌观察的同时，还可对样品成分、结构以及电特性进行分析。
   

    图3  扫描电镜工作原理

    透射电镜的工作机理是利用电子束在外部磁场或电场的作用下发生弯曲，形成类似于可见光经过玻璃时的透射现象，称为电子束“透镜”，利用透过样品的电子束成像。透射电镜在材料科学研究领域发挥了重要作用，可实现样品形貌观察、物相分析、确定晶格结构、观察晶格缺陷、化学成分分析、元素分析等功能，成为在光学显微镜不能达到要求时进行微观分析和检测的不可或缺的工具。
    (3)X射线显微镜
    20世纪50年代以来，出现了一种不用光波或电子而用X射线作为信息载体的显微镜，它为人们提供了一种更深入观察微观世界的方法。X射线是指波长为(0.01～30)nm的辐射波，其中，(1～30)nm的波段称为软X射线。近年来，世界范围内积极进行的X射线显微术方面的研究主要集中在软X射线波段。软X射线显微镜的突出优点是可以在生物活细胞被破坏之前得出其表面特征和内部结构的图像，这是电子显微镜无法得到的。自20世纪70年代以来，随着X射线激光器的开发与发展，获得了短脉冲、高亮度和相干性强的X射线激光光源，此外，用于X射线的光学元件与高分辨率、高灵敏度的X射线探测器技术的发展为X射线显微镜的发展创造了必要条件，使其具有高空间分辨、能谱分辨和时间分辨能力。
    目前，X射线显微镜主要包括接触型、成像型、扫描型以及全息型四种类型。图4为软X射线接触显微成像示意图，它用光敏物质作为抗蚀材料，将实验样品贴在对X射线灵敏的感光胶上，经过软X射线曝光及显影，再用电子显微镜观察其影像即可得到细胞的显微图，这种方法比较简单和方便，分辨率可达10nm。
   

    图4  软X射线接触显微成像简图

   （待续）

成像型软X射线显微镜模拟光学成像原理，用聚焦系统将影像放大数百倍，然后由光电耦合(CCD)探测器实时记录，聚焦系统以波带片代替透镜。这种方法的优点是可以照射整个样品并实时成像，非常适合实际应用，其分辨率可达(50～60)nm。软X射线扫描显微镜是用波带片将软X射线聚焦成一个微束，照亮样品上的一个点，该点对X射线的透射率确定了像素的灰度值，对样品逐行逐点进行扫描，图像便以一次一个像素方式形成，很像电视屏上的图像。这种显微镜的优点是样品辐射损伤小，缺点是需逐点记录得出图像，要求空间相干照明，且不能使用脉冲X射线光源。全息型X射线显微镜基于波的干涉原理，它不需要聚焦装置，只需要强X射线光源和高分辨率的记录材料，可获得样品的三维全息影像。用(0.1～1)nm的X射线激光全息术可进行表面物理、原子分子物理、化学反应动力等高分辨率快速过程的研究。
    X射线显微镜与电子显微镜功能上互为补充，电子显微镜可达到极高的分辨率——(0.2～2)nm，现有X射线显微镜的分辨率是在几十纳米的量级，由于受到X射线衍射限度的限制，X射线显微镜的分辨率难以超越电子显微镜。因此，X射线显微镜的主要贡献并不在于分辨率极限的突破，而在于它在很接近于生物体自然状态的环境下，对改变很少或完全没有改变的生物样品进行定量测定的能力。因此，X射线显微镜在生物医学领域中的应用更加引人注目，从被重金属污染了的生物到人体内的癌细胞，X射线显微镜为人类在原子尺度考察生命提供了帮助。
    (4)近场显微镜
    近场显微镜的概念是由Wickramasinghe提出的，最早由扫描探针显微镜(SPM)的测量原理延伸得到。它是一种全新的测量原理，即使得一个非常尖的探针非常近地接近样品，使之与被测表面在近场范围产生扫描力，对这种扫描力进行探测可获得样品表面的形貌信息。近场显微镜具有非常高的分辨率，因为它区别于传统光学显微镜之处在于，不再用光子或粒子束照亮样品，因而突破了由于射线衍射造成的分辨率极限。近场显微镜的关键之处是各种形式的探针在原子直径量级上的精确机械扫描，以及探针在近场范围对样品表面进行原子和分子量级的探测。
    扫描探针显微镜家族的第一个成员是扫描隧道显微镜(STM)，它是由IBM瑞士苏黎世实验室的G.Beinning和H.Rohrer于1982年发明的，接下来是原子力显微镜(AFM)。此后，又陆续发明了多种利用扫描力测量的显微镜，如近场光学显微镜(NOM)、近场声学显微镜(NAM)、摩擦力显微镜(FFM)、磁力显微镜(MFM)、静电力显微镜(EFM)和化学力显微镜(CFM)等，使得SPM的组成和应用领域大大扩大。
    SPM作为新型显微工具与以往的各种显微镜和分析仪器相比有着其明显地优势:首先，SPM具有极高的分辨率。它可以轻易地“看到”原子，这是一般显微镜甚至电子显微镜所难以达到的。其次，SPM得到的是实时的、真实的样品表面的高分辨率图像，而不同于某些分析仪器是通过间接的或计算的方法来推算样品的表面结构。也就是说，SPM是真正看到了原子。再次，SPM的使用环境宽松。电子显微镜等仪器对工作环境要求比较苛刻，样品必须安放在高真空条件下才能进行测试。而SPM既可以在真空中工作，又可以在大气中、低温、常温、高温甚至在溶液中使用。因此，SPM适用于各种工作环境下的科学实验。SPM的缺点在于:一方面，由于其工作原理是控制具有一定质量的探针进行扫描成像，因此扫描速度受到限制，检测效率较其他显微技术低；此外，由于压电效应在保证定位准确度前提下运动范围很小(目前难以突破100μm量级)，而机械调节准确度又无法与之衔接，故不能做到像电子显微镜那样大范围连续变焦，定位和寻找特征结构比较困难。虽然存在缺点，但SPM的应用领域还是非常宽广的，无论是物理、化学、生物、医学等基础学科，还是材料、微电子等应用学科都有它的用武之地。预计在未来的科学发展中，SPM将具有更大的应用前景。
    三、显微技术在长度计量中的应用
    显微技术是长度计量的基本技术，近年来，显微技术与光干涉技术相结合在长度计量领域的各分支(如量块计量、角度计量、工程参量计量、表面轮廓以及纳米计量)中发挥了重要作用，使得古老的显微技术焕发了新的活力。
    1.在几何尺寸测量中的应用
    测量显微镜是长度计量的常用精密测量仪器，主要用于工件几何尺寸的测量。从小型测量显微镜到大型工具显微镜，测量显微镜的类型多种多样，测量准确度一般为微米量级，分辨率可达到0.1μm。
    2.在表面形貌测量中的应用
    表面形貌测量是长度计量的一个分支，传统仪器有光切显微镜和干涉显微镜，光切显微镜的分辨率最高可达到0.1mm，而干涉显微镜则可达到15nm。它们所针对的主要是微米、亚微米量级的工件粗糙度的测量。
    随着表面加工质量的不断提高，对微观形貌测量技术提出了更高的要求。轮廓仪、扫描电镜以及扫描探针显微镜的应用解决了这一问题。其中，STM和AFM的发明为表面形貌测量的进一步发展注入了新的活力，使其步入了纳米时代。当前，表面形貌测量正朝着应用非接触式且具有高分辨率，以及可对表面结构和成分进行描绘的电子显微镜方向发展。
    3.在线宽和掩模测量中的应用
    随着电子行业的发展，特别是超大规模集成芯片制造业的进一步发展，电子元器件向着结构尺寸小型化和高集成密度化方向前进，从而对线宽计量和掩模计量提出更高的需求。近年来，共焦显微镜的应用为线宽和掩模测量提供了新的测量手段。共焦显微镜的原理如图5所示，激光通过一个长焦透镜后形成发散光束，再经短焦物镜汇聚透射到样品表面并反射回短焦物镜，经分光镜后通过一个小孔光阑由光电接收器接收。小孔光阑的位置正好位于长焦透镜的焦点上，因而构成共焦关系。当测量点正好位于物镜焦点上时，光电接收器上可得到最大的信号，随着测量点偏离焦点，信号随之变小，信号的大小即反映了样品表面高低的变化。小孔的直径对其测量分辨率起决定作用，目前，共焦显微镜的测量分辨率可达到10nm。
   

    图5  共焦显微镜成像原理图

四、结束语
    回顾几百年来显微技术的发展，显微镜就像人类的第三只眼睛，为我们探索和研究微观世界开启了一扇门。近几十年，显微技术的奋斗目标主要是力求观察更微小的物体结构、更细小的实体，甚至单个原子，并获得有关试样的更多的信息。古老的显微技术在激光技术和电子技术的激励下迸发出新的能量。相信在未来的科学发展中，现代新型显微镜的应用将渗透到各个科学技术领域。
    作者单位【王蔚晨  杨自本  中国计量科学研究院、何冬琦  广东省计量科学研究院、莫伟平  云南省计量测试技术研究院】