酶标仪单、双波长检测的比较

酶标仪单、双波长检测的比较
             邱娜
【关键词】　酶标仪　　波长
【中图分类号】　R446. 11　　【文献标识码】　B　　【文章编号】　167122587 (2007) 0120061201
应用酶联免疫法测定抗原或抗体时, 结果的判读要求使用酶标仪, 一般酶标仪有单波长和双波长两种测定模式,且采用的都是垂直光路。在日常工作材料与方法
1　材料　由上海科华公司提供乙肝表面抗原测定试剂盒,50～ 200 Ll 的移液器。
2　仪器　酶标仪HT 3 (奥地利)。
3　方法　底物液的配制: 显色剂A、B 各5 m l 混合, 加入微量酶标记物, 再加入5 m l 终止液, 呈微黄色液体混匀待用。
利用上海科华公司提供的乙肝表面抗原试剂盒的酶标板,于94 孔中准确加入150 Ll 配制好的上述底物液, 另2 孔加入150 Ll 已终止的空白底物液作空白, 在酶标仪HT 3 上分别进行450 nm 单波长和450 nm 及620 nm 双波长检测吸光度2 次。
结　　果
　单、双波长测定结果不同, 双波长测定结果的CV 值远小于单波长测定结果。见表1～ 2。表中, 如果不能正确选用单波长或双波长, 易出现测定孔的数值为负数或弱阳性甚至漏检的现象.
　单波长比色是通过对显色具有最大吸收的波长如450nm 或492 nm 进行比色测定, 而双波长则是酶标仪在敏感波长如450 nm 和非敏感波长620 nm 下各测定1 次, 敏感波长下的吸光度测定值为测定酶反应特异性显色的吸光度与板底上被脏物污染后的吸光度之和, 非敏感波长下测定, 是改变波长至一定值, 使酶反应特异显色的吸光度值为零, 此时测得的吸光度即为脏物的吸光度, 最后酶标仪给出的数值为敏感波长吸光度值与非敏感波长的吸光度值的差。因此, 在实际工作中, 使用双波长不必设空白孔, 否则可能造成测定孔负数的现象。
　　酶标仪在用单波长测定吸光度时, 除受到板底脏物污染等干扰因素外, 还受液面张力的影响。在检测过程中, 由于液体表面张力的作用, 光线通过液面时, 除正常被液体吸收一部分外, 尚有部分被折射和反射, 影响吸光度的检测;使用的是通过光导纤维传播的点光源, 但机械运动等因素可造成误差, 不可能保证每孔都在相同部位被检测, 那么吸光度的重复性将无法得到保证, 造成孔与孔之间有一定的差异(结果见表1)。整块板单波长检测的CV 在3% 以上, 吸光度最高值和最低值的相对误差也较大。　在双波长测定中, 由于减少了干扰测定的一些因素, 因此测定结果明显好转, 整块板样本的CV 在3% 以下。此外,性分析结果基本一致。
　　

应用酶联免疫法测定抗原抗体时, 由于使用的底物不论是邻苯二胺还是四甲基联苯胺, 显色终止后在620 nm 处的吸光度值都只有吸收峰处450 nm 吸光度的1% 以下。因此, 利用双波长检测不会影响灵敏度, 建议采用酶联免疫检测时, 酶标仪比色应该选用双波长, 可提高临界值处标本的分析正确度, 减少实验误差。